Microscope super résolution Zeiss Elyra SP.1

Elyra

Local : A-209 (voir Aurélien Fouillen)
Support technique : Monique Vasseur et Nicolas Stifani
Mode d’emploi SR-SIM (à venir)
Mode d’emploi PALM 3D
Préparation des échantillons pour la super-résolution

  • Microscope super résolution SR-SIM et PALM 3D
  • Inversé Axio Observer Z1 entièrement automatisé
  • Imagerie 6D (XYZTC et multi-positions)
  • Caméras EMCCD, 14 bit
  • Lasers alignés à +/- 0,1° jusqu’aux caméras
  • Piezos XYZ
  • Mise au point automatique par algorithme
  • Incubateur anti-courant d’air (sans °T ni CO2)

Applications
  • Microscopie super-résolution pour cellules fixées (SR-SIM) ou cellules vivantes (mais sans température ni CO2)
  • SR-SIM (Super-Resolution Structured Illumination Microscopy) : résolution théorique de ~100 nm
  • 3D-PALM (3D Photo Activated Localization Microscopy)
  • dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) : résolution théorique de ~20 nm en xy, 50 nm en z
  • Épifluorescence plein champ (wide-field)
  • Fond clair (Brightfield) seulement. Pas de DIC ni de contraste de phase
  • Imagerie multidimensionnelle 6D (XYZTC et multi-positions) et traitement des images en lot (batch processing)

Super résolution - module Elyra SP.1
  • SR-SIM : la grille structurante est automatiquement choisie et optimisée selon la longueur d’onde d’excitation
  • dSTORM et 3D PALM
Objectifs
  • 10x/0.30 EC Plan Neofluar DIC I; distance de travail: WD 5,2 mm (Zeiss 420340-9901-000)
  • 63x/1.4 oil Plan Apo DIC III; distance de travail : WD 0,10 mm; immersion à l’huile (Zeiss 420782-9900-799)
    Cet objectif fournit un meilleur PSF (Point Spread Function shape) que le 100x/1.46 oil.

NB: En super résolution, l’Optovar 1,6x est toujours dans le trajet optique. En fond clair, il est souvent retiré (lentille 1x)

Sources lumineuses
  • Lasers pour la super résolution et pour l’épifluorescence plein champ :
    • Laser 405 nm, 50 mW, HR diode, puissance réglable avec 5 filtres de densité neutre (ND filters)
    • Laser 488 nm, 100 mW, HR diode, puissance réglable avec AOTF
    • Laser 561 nm, 100 mW, HR DPSS puissance réglable avec AOTF
    • Laser 642 nm, 150 mW, HR diode puissance réglable avec 1 filtre de densité neutre (ND filter)

    NB : pour de l’imagerie quantitative, les lasers doivent être allumés de 60 à 90 minutes avant la capture d’images

  • Lampe metal-halide X-Cite series 120 Q d’Excelitas, pour l’épifluorescence aux oculaires ou pour l’imagerie plein champ
  • Lampe halogène pour lumière transmise
Détecteurs
  • TV1 pour PALM/STORM (side port): EMCCD iXon EM+ DU-897D-CS0-#BV-462 d’Andor
    • Back illuminated, >90% QE; Détection d’un photon à la fois, optimisée pour le visible
    • 512×512, 16 µm, 35 fps (full chip) à plusieurs centaines de fps
    • 14 bits; 10, 5, 3 et 1 MHz
    • Refroidie à -80°C, bruit d’intégration (Readout noise) de 49 e- à 10 MHz ou de 32 e- à 3 MHz
  • TV2 pour SR-SIM (bottom port) : EMCCD iXon3 DU-885K CSO VP461 d’Andor
    • QE 65%
    • Image acquise full chip : 1004×1002, pixel de 8 µm chacun, 31 fps (full chip) à 13 812 fps
    • Image full chip après traitement SR-SIM : 1904×1900
    • 14 bits; 35, 27 et 13 MHz
    • Refroidie à -80°C, bruit d’intégration (Readout noise) de 25 e- à 35 MHz ou de 12 e- à 13 MHz
  • Front Port : rien
Filtres
  • Cubes de filtres pour observation aux oculaires (avec la lampe X-Cite 120Q)
    • Plate : Vide pour lumière transmise
    • GFP + mRFP + Alexa633 (Zeiss set 77 HE : 489077-0000) pour épifluorescence 3 couleurs à la fois
      • Excitation : 482 + 563 + 642 (HE)
      • Dichroïques : 506 + 582 + 659 (HE)
      • Émission : 526 + 601 + 688 (HE)
  • Cubes de filtres pour la super résolution
    • DAPI (Zeiss SR cube 07) : BP 450/60 (420-480) + LP750
    • GFP (Zeiss SR cube 13) : BP 543/95 (495-590) + LP750
    • RFP (Zeiss SR cube 14) : LP570
    • Cy5 (Zeiss SR cube 10) : LP655
Précision de la platine et de la mise au point en Z
  • Déplacements en XY : pas de 200 nm (200 nm step)
  • Déplacements en Z
    • Grossier par vis micrométrique du microscope : pas de 25 nm (25 nm Z step)
    • Fin par Piezo de l’encart porte-spécimen (Stage Piezo Focus) de PI: pas de 5 nm (5 nm Z step)
      • Maximum de poids permis : < 100 g
      • Réchauffement minimum : 30 min.
      • Reproductibilité : mieux que 40 nm
      • Déplacement maximal possible (Maximum travel) : 100 µm
  • Autofocus avec Definite Focus
Incubation
  • Cabinet-incubateur anti-courant d’air noir opaque (sans contrôleur de température ni de CO2)
Contenants et porte-échantillon compatibles avec la platine (différents encarts)
  • Lame de 1,0 mm d’épais avec lamelle de 0,170 mm (Zeiss)
  • Pétri de 36 mm de diamètre avec fond en lamelle de verre de 0,170 mm
  • Lame multipuits avec fond en lamelle de verre (lame ayant des rebords qui dépassent de la zone des puits)
Logiciel
  • ZEN (black) de Zeiss
Support technique
  • Monique Vasseur, responsable de la plateforme de microscopie photonique
  • Nicolas Stifani, Coordonnateur Microscopie avancée


Dernière mise à jour : 12 octobre 2018