Microscope super résolution Diskovery Flex de Quorum

Quorum

Local : 3134, pav. J.-Armand-Bombardier
Support technique : Nicolas Stifani et André Lévesque
Mode d’emploi (à venir)

  • Microscope super résolution PALM/STORM 2D et 3D
  • Inversé DMI 6000 de Leica avec autofocus intégré
  • 4 types de microscopie sur le même champ
  • Confocal multi-points (Nipkow spinning disk)
  • TIRF multi-couleurs et à différentes profondeurs
  • Photomanipulation
  • Imagerie 5D (XYZTC) et multi-modale
  • 2 caméras BSI sCMOS, Prime 95B, 16 bit
  • Moteur Z, platine manuelle
  • Mise au point automatique par algorithme et par LED 800 nm
Applications
  • Microscopie super-résolution pour cellules fixées ou vivantes (mais sans température ni CO2)
  • Imagerie multimodale (confocal multipoints, TIRF 4 couleurs, super résolution et épifluorescence sur le même champ)
  • dSTORM 2D et 3D (3D direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
  • PALM 3D (3D Photo Activated Localization Microscopy)
  • Photomanipulation
  • Confocal multipoints (Nipkow Spinning Disk)
  • TIRF multi couleurs et à profondeur réglable (TIRF : Total Internal Reflection Fluorescence)
  • Épifluorescence à champ large (wide-field)
  • Fond clair (Brightfield) et polarisation seulement. Pas de DIC ni de contraste de phase
  • Imagerie multidimensionnelle 5D (XYZTC) et multimodale (option de deux caméras en simultané)

Super résolution - Microscopie de localisation (single-molecule imaging)
  • dSTORM et PALM avec l’algorithme Wave Tracer et le module Diskovery d’Andor
  • 3D dSTORM avec lentille astigmatique placée manuellement devant la caméra horizontale
  • La lentille astigmatique est amovible afin de pouvoir utiliser la caméra pour les autres applications

Confocal multipoints

Module Diskovery d’Andor

  • Disque rotatif Nipkow (à un seul disque; pas de 2e disque avec microlentilles) et amovible
  • Disque à vitesse de rotation fixe : 5000 rpm
  • 3 choix de grosseurs de pinhole sur le même disque :
    • 33 µm (grande zone (1/2) sur le rayon interne du disque) : idéal pour les objectifs 63x et 20x
    • 50 µm(petite zone (1/4) au milieu): idéal pour le 100x et le 20x
    • 75 µm (petite zone (1/4) sur le rayon externe du disque) : si manque de signal

    TIRF

    Module Diskovery d’Andor

    • TIRF 4 couleurs; avec les lasers 405, 488, 561 et 637 nm (mais pas avec le 515 nm)
    • Multimodale TIRF avec épifluorescence; ex. GFP en TIRF + mCherry en épifluorescence (acquis en séquentiel sur une caméra)
    • Profondeur de pénétration réglable : 80 à 800 nm
    • Le TIRF est configuré uniquement pour l’objectif 63x

    Objectifs
    • 20x/0.70 HC Plan Apo; couvre-objet de 0,17 mm, distance de travail (WD) 0,59 mm (Leica 11506166)
    • 63x/1.47 oil HCX Plan Apo corr TIRF; couvre-objet 0,10 – 0 22 mm, WD 0,10 mm; immersion à l’huile (Leica 11506319)
    • 100x/1.47 oil HCX Plan Apo corr TIRF; couvre-objet 0,10 – 0 22 mm, WD 0,10 mm; immersion à l’huile (Leica 11506318)

    NB : Le condensateur à une ouverture numérique de 0.55. Le diaphragme d’ouverture est motorisé.


    Sources lumineuses
    • Système Borealis d’Andor pour combiner et moduler les lasers, pour tous les modes d’imagerie sauf pour le TIRF
      • Illumination uniforme (moins de 8% de variation dans un champ) et de forme carrée
      • Le champ illuminé est carré (4 grandeurs) – NB : sauf pour le TIRF qui utilise une autre fibre
      • La puissance d’illumination varie selon le carré choisi : Plus le carré est petit, plus la lumière est concentrée

    NB : La sélection de la grandeur du carré étant lente à changer, il est conseillé d’utiliser la même grandeur de champ d’illumination durant tout un protocole expérimental.

    • Module iLas Pulse pour permettre la phtomanipulation (dans le moment qu’avec le laser 405 nm)
    • Lasers (# 1A, Spectral d’Andor) pour la super résolution, le confocal multipoints, le TIRF et l’épifluorescence à champ large :
      • Laser 405 nm, 100 mW, diode OPSL (ON/OFF en ms)
      • Laser 488 nm, 150 mW, diode OPSL (ON/OFF en ms)
      • Laser 561 nm, 150 mW, (nécessite réchauffement de 2 minutes et un obturateur pour la capture d’images)
      • Laser 637 nm, 140 mW, diode OPSL (ON/OFF en ms)
    • Lasers (# 1B, Spectral d’Andor) pour la super résolution, le confocal et l’épifluorescence mais NON DISPONIBLE POUR LE TIRF:
      • Laser 515 nm, 150 mW (nécessite réchauffement de 2 minutes et un obturateur pour la capture d’images)
    • Lampe halogène pour la lumière transmise

    Détecteurs
    • 2 Caméras BSI sCMOS identiques: Prime 95B de Photometrics
      • BSI: Backside illuminated;  >95% QE
      • 1200×1200; 11 µm;  16 bit
      • 41 fps (full chip, 16 bit); 82 fps (full chip, 12 bit); 768 fps (1200×128, 12 bit)
      • Binning: 2×2 on FPGA (2×2 on-camera simulated binning)
      • Readout mode: Rolling shutter or Global shutter
      • Full well capacity: 80 000 e- (gain combiné), 4 500 e- (à gain élevé)
      • Refroidie de -10oC; bruit d’intégration (Readout noise) < 1,8 e- rms

    La super-résolution 3D n’est possible que sur la caméra horizontale.


    Filtres
    • Cubes de filtres (tourelle motorisée à 6 positions) :
      • DAPI (Chroma 49000 ET): BP AT 350/50x T LP 400 BP ET 460/50m
      • GFP (Chroma 49002 ET): BP ET 470/40x T LPxr 495 BP ET 525/50m
      • YFP (Chroma 49003 ET): BP ET 500/20x T LP 515 BP ET 535/30m
      • Cy5.0 (Chroma 49006 ET): BP ET 620/60x T LPxr 660 BP ET 700/75m
    • Roue de filtres à l’émission (8 positions, filtres de 25 mm de diamètre), amovible et interchangeable entre caméras
      • DAPI (Chroma ET450/50m) : BP ET 450/50
      • GFP (Chroma ET525/50m) : BP ET 525/50
      • CY3 (Chroma ET600/50m) : BP ET 600/50
      • CY5.0 (Chroma ET700/75m) : BP ET 700/75
      • mCherry (Chroma ET620/60m) : BP ET 620/60
      • YFP (Chroma ET540/30m) : BP ET 540/30
      • Obturateur (Shutter)
      • Vide (empty)
      • Filtre à l’émission, sur tirette amovible
      • GFP (Chroma ET525/50m) : BP ET 525/50

    Précision de la platine et de la mise au point en Z
    • Déplacement manuel en XY
    • Déplacements en Z du microscope : motorisé avec pas de 50 nm
    • Autofocus du microscope (AFC) et autofocus avec algorithme de Metamorph

    Incubation
    • Pas de boite d’incubation globale mais possibilité d’utiliser la chambre amovible FCS2 de Bioptechs

    Accessoires
    • Chambre environnementale FCS2 de Bioptechs (FCS2 : Focht Live-Cell Chamber System)
      • Chambre de perfusion fermée compatible avec le DIC, la fluorescence et les objectifs à immersion
      • Micro-perfusion par un système de Microaqueduct: 0,2 – 180 ml/h
      • Échange complet du milieu possible par la pompe péristaltique en 1 sec. (max.)
      • Contrôle de la température de la chambre : ambiante – 50oC +/-0,1oC
      • Volume de la chambre : 6,6 – 706 µl selon l’épaisseur du joint de montage (50 – 1000 µm)
      • Champ visuel : 22 mm de diamètre
      • Nécessite culture sur lamelle de 40 mm de diamètre et 0,17 mm d’épaisseur
      • Chauffe-objectif compatible avec les objectifs de 26 à 35 mm de diamètre (100x à immersion)
      • Incubateur Boekel: mini-étuve portative pour garder le milieu de perfusion à la bonne température

    Contenants et porte-échantillons compatibles avec la platine (différents encarts)
    • Lame et lamelle
    • Pétri de 36 mm de diamètre avec fond en lamelle de verre de 0,170 mm
    • Lame multipuits avec fond en lamelle de verre
    • Chambre FCS2 de Bioptechs

    Logiciel
    • Metamorph (incluant Wave Tracer) de Molecular Devices

    Support technique
    • Nicolas Stifani, coordonnateur de la Microscopie avancée, Faculté de médecine
    • André Lévesque, responsable des plateformes de microscopie et d’histologie du CIB


    Dernière mise à jour : 27 octobre 2023