Microscope super résolution Diskovery Flex de Quorum

Quorum

Local : D-509
Support technique : Monique Vasseur
Mode d’emploi (à venir)

  • Microscope super résolution PALM/STORM 2D et 3D
  • Inversé DMI 6000 de Leica avec autofocus intégré
  • 4 types de microscopie sur le même champ
  • Confocal multi-points (spinning disk)
  • TIRF multi-couleurs et à différentes profondeurs
  • Imagerie 5D (XYZTC) et multi-modale
  • Caméras EMCCD et sCMOS, 16 bit
  • Moteur Z, platine manuelle
  • Mise au point automatique par algorithme et par LED 800 nm

Applications

  • Microscopie super-résolution pour cellules fixées ou vivantes (mais sans température ni CO2)
  • Imagerie multimodale (confocal multipoints, TIRF 4 couleurs, super résolution et épifluorescence sur le même champ)
  • dSTORM 2D et 3D (3D direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
  • PALM 3D (3D Photo Activated Localization Microscopy)
  • Confocal multipoints (Spinning Disk)
  • TIRF multi couleurs et à profondeur réglable (TIRF : Total Internal Reflection Fluorescence)
  • Épifluorescence à champ large (wide-field)
  • Fond clair (Brightfield) et polarisation seulement. Pas de DIC ni de contraste de phase
  • Imagerie multidimensionnelle 5D (XYZTC) et multimodale (mais usage d’une caméra à la fois)

Super résolution – Microscopie de localisation (single-molecule imaging)

  • dSTORM et PALM avec l’algorithme Wave Tracer et le module Diskovery d’Andor
  • 3D dSTORM avec lentille astigmatique placée manuellement devant la caméra EMCCD ImagEMx2 de Hamamatsu
  • La lentille astigmatique est amovible afin de pouvoir utiliser la caméra EMCCD pour les autres applications

NB : Avec la configuration actuelle, la sCMOS ne peut être utilisée que pour la super-résolution 2D (pas la 3D)

Confocal multipoints – Module Diskovery d’Andor

  • Disque rotatif Nipkow (à un seul disque; pas de 2e disque avec microlentilles) et amovible
  • Disque à vitesse de rotation fixe : 5000 rpm
  • 3 choix de grosseurs de pinhole sur le même disque :
    • 33 µm (grande zone (1/2) sur le rayon interne du disque) : idéal pour les objectifs 63x et 20x
    • 50 µm(petite zone (1/4) au milieu): idéal pour le 100x et le 20x
    • 75 µm (petite zone (1/4) sur le rayon externe du disque) : si manque de signal
  • N’importe quelle grosseur de pinhole (zone sur le disque) peut être utilisée pour la caméra EMCCD
  • Pour la caméra sCMOS qui couvre un plus grand champ que la caméra EMCCD, la zone à 33 µm permet une image Full chip avec la même grosseur de pinhole dans tout le champ. Les zones à 50 et 75 µm nécessitent la capture d’un champ plus petit.

NB : Attention aux caméras! Ne pas les éblouir entre deux modes d’imagerie.
Lorsqu’on retire le disque rotatif du trajet lumineux, on augmente de 90% la puissance d’illumination;
Donc arrêter la capture d’image Stop Live ou corriger le temps d’exposition, avant de retirer le disque rotatif.

TIRF – Module Diskovery d’Andor

  • TIRF 4 couleurs; avec les lasers 405, 488, 561 et 637 nm (mais pas avec le 515 nm)
  • Multimodale TIRF avec épifluorescence; ex. GFP en TIRF + mCherry en épifluorescence (acquis en séquentiel sur une caméra)
  • Profondeur de pénétration réglable : 80 à 800 nm
  • Le TIRF est configuré uniquement pour l’objectif 63x

Objectifs

  • 20x/0.70 HC Plan Apo; couvre-objet de 0,17 mm, distance de travail (WD) 0,59 mm (Leica 11506166)
  • 63x/1.47 oil HCX Plan Apo corr TIRF; couvre-objet 0,10 – 0 22 mm, WD 0,10 mm; immersion à l’huile (Leica 11506319)
  • 100x/1.47 oil HCX Plan Apo corr TIRF; couvre-objet 0,10 – 0 22 mm, WD 0,10 mm; immersion à l’huile (Leica 11506318)

NB : Le condensateur à une ouverture numérique de 0.55. Le diaphragme d’ouverture est motorisé.

Sources lumineuses

  • Système Borealis d’Andor pour combiner et moduler les lasers, pour tous les modes d’imagerie sauf pour le TIRF
    • Illumination uniforme (moins de 8% de variation dans un champ) et de forme carrée
    • Le champ illuminé est carré (4 grandeurs) – NB : sauf pour le TIRF qui utilise une autre fibre
    • La puissance d’illumination varie selon le carré choisi : Plus le carré est petit, plus la lumière est concentrée

NB : La sélection de la grandeur du carré étant actuellement manuelle (pas encore avec l’ordi) et lente à changer, il est conseillé d’utiliser la même grandeur de champ d’illumination durant tout un protocole expérimental.

  • Lasers (# 1A, Spectral d’Andor) pour la super résolution, le confocal multipoints, le TIRF et l’épifluorescence à champ large :
    • Laser 405 nm, 100 mW, diode OPSL (ON/OFF en ms)
    • Laser 488 nm, 150 mW, diode OPSL (ON/OFF en ms)
    • Laser 561 nm, 150 mW, (nécessite réchauffement de 2 minutes et un obturateur pour la capture d’images)
    • Laser 637 nm, 140 mW, diode OPSL (ON/OFF en ms)
  • Lasers (# 1B, Spectral d’Andor) pour la super résolution, le confocal et l’épifluorescence mais NON DISPONIBLE POUR LE TIRF:
    • Laser 515 nm, 150 mW (nécessite réchauffement de 2 minutes et un obturateur pour la capture d’images)
  • Lampe métal-halide X-Cite series 120 Q d’Excelitas, pour l’épifluorescence aux oculaires.
  • Lampe halogène pour la lumière transmise

Détecteurs

  • Caméra EMCCD pour PALM/STORM 3D (position horizontale): ImagEMx2 d’Hamamatsu
    • Back illuminated, 92% QE @ 580 nm; Détection > 10 photons/pixel
    • 512×512; 16 µm; 70 fps (full chip) à 1076 fps avec ROI ou binning; On-chip binning : 2, 4
    • Temps d’exposition minimum : 14 ms; Temps d’exposition maximum : 7200 s
    • 16 bits; 11 et 22 MHz; Full well capacity : 370 000 e-
    • EM gain : de 4x à 1200x;
    • Refroidie à -65°C, bruit d’intégration (Readout noise) < 1 e- rms au gain maximum de 1200x
    • Sonnerie d’alarme Anti-blast pour avertir que la caméra reçoit trop de lumière (si cela arrive trop souvent, le gain de la caméra va en souffrir). Ainsi aussitôt que l’alarme sonne, dans MetaMorph, appuyer sur F2 ou Stop Live
  • Caméra sCMOS de 2e génération (position verticale) : Orca-Flash4.0 V2 USB 3.0 de Hamamatsu
    • 72% QE @ 580 nm; Détection > 6 photons/pixel
    • 2048×2048, 6,5 µm, 30 fps (full chip) à 25 655 fps; Digital binning : 2,4
    • Temps d’exposition minimum : 1 ms; Temps d’exposition maximum : 10 s
    • 16 bits
    • Bruit d’intégration (Readout noise) de 1,9 e-rms

NB : De préférence, choisir le digitaliseur en mode haute précision plutôt que haute vitesse

NB : On ne peut pas utiliser les 2 caméras en même temps. Le déviateur pour le choix de la caméra est manuel. Pour le bon fonctionnement du logiciel, Il est préférable de n’allumer que la caméra à utiliser.

Filtres

  • Cubes de filtres (tourelle motorisée à 6 positions) :
    • DAPI (Chroma 49000 ET): BP AT 350/50x T LP 400 BP ET 460/50m
    • GFP (Chroma 49002 ET): BP ET 470/40x T LPxr 495 BP ET 525/50m
    • YFP (Chroma 49003 ET): BP ET 500/20x T LP 515 BP ET 535/30m
    • Cy5.0 (Chroma 49006 ET): BP ET 620/60x T LPxr 660 BP ET 700/75m
  • Roue de filtres à l’émission (8 positions, filtres de 25 mm de diamètre), amovible et interchangeable entre caméras
    • DAPI (Chroma ET450/50m) : BP ET 450/50
    • GFP (Chroma ET525/50m) : BP ET 525/50
    • CY3 (Chroma ET600/50m) : BP ET 600/50
    • CY5.0 (Chroma ET700/75m) : BP ET 700/75
    • mCherry (Chroma ET620/60m) : BP ET 620/60
    • YFP (Chroma ET540/30m) : BP ET 540/30
    • Obturateur (Shutter)
    • Vide (empty)
    • Filtre à l’émission, sur tirette amovible
    • GFP (Chroma ET525/50m) : BP ET 525/50

Précision de la platine et de la mise au point en Z

  • Déplacement manuel en XY
  • Déplacements en Z du microscope : motorisé avec pas de 50 nm
  • Autofocus du microscope (AFC) et autofocus avec algorithme de Metamorph

Incubation

  • Aucune incubation possible dans le moment

Contenants et porte-échantillons compatibles avec la platine (différents encarts)

  • Lame et lamelle
  • Pétri de 36 mm de diamètre avec fond en lamelle de verre de 0,170 mm
  • Lame multipuits avec fond en lamelle de verre

Logiciel

  • Metamorph de Molecular Devices
  • Wave Tracer de Molecular Devices

Support technique

  • Monique Vasseur, responsable de la plateforme de microscopie photonique
  • Jacqueline Kowarzyk, agente de recherche dans le laboratoire du Dr S. Michnick